КОМПЛЕКСНАЯ СТРАТЕГИЯ КОНТРОЛЯ МИКРОБНЫХ БИОПЛЕНОК В ПТИЦЕВОДСТВЕ: ОТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ МЕХАНИЗМОВ К ПРАКТИЧЕСКОЙ РЕАЛИЗАЦИИ

УДК 636.5.082.4:579.252

КОМПЛЕКСНАЯ СТРАТЕГИЯ КОНТРОЛЯ МИКРОБНЫХ БИОПЛЕНОК В ПТИЦЕВОДСТВЕ: ОТ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ МЕХАНИЗМОВ К ПРАКТИЧЕСКОЙ РЕАЛИЗАЦИИ

Е.В. Колуга
Директор ООО «Стемтрикс»
ek@rezovet.ru

АННОТАЦИЯ
Глобальный кризис антимикробной резистентности диктует необходимость разработки устойчивых альтернатив антибиотикам в животноводстве. Микробные биопленки, являясь доминирующей формой существования бактерий, играют дуалистическую роль в желудочно-кишечном тракте птицы: патогенные биопленки усиливают вирулентность и устойчивость к лечению, в то время как полезные – критически важны для гомеостаза кишечника. В данном исследовании представлена комплексная стратегия направленной модуляции биопленок, основанная на применении фитогенных соединений и их комбинаций с органическими кислотами. Методами in vitro (определение MBEC, конфокальная микроскопия, ПЦР-РТ) и in vivo (эксперимент на 1100 бройлерах) продемонстрировано, что комплексная фитогенная добавка (КФД) «Резовет», содержащая синергическую композицию алкилрезорцинолов, индольных соединений и монобутиратов, селективно разрушает патогенные биопленки (Escherichia coli, Clostridium perfringens, Salmonella Enteritidis) за счет ингибирования кворум-сенсинга и дестабилизации внеклеточного матрикса. Параллельно КФД стимулирует формирование полезных мукозных биопленок с доминированием Akkermansia muciniphila и бутират-продуцентов. Выявлен выраженный синергизм комбинации «Резовет» с органической кислотой «Лупрозил» (индекс FIC 0,28-0,35), что позволило в условиях in vivo улучшить конверсию корма на 4,8%, увеличить сохранность поголовья на 3,9% и снизить контаминацию Salmonella spp. на 2,1 log КОЕ/г. Экономический анализ подтвердил высокую рентабельность применения как монотерапии КФД (ROI 567%), так и комбинированных схем (ROI 507%). Результаты позиционируют направленную модуляцию биопленок как эффективную и экономически целесообразную стратегию для устойчивого птицеводства в пост-антибиотическую эру.

Ключевые слова: микробные биопленки, фитогенные добавки, алкилрезорцинолы, кворум-сенсинг, Akkermansia muciniphila, органические кислоты, синергизм, птицеводство, антимикробная резистентность, экономическая эффективность.

ABSTRACT

The global antimicrobial resistance crisis necessitates the development of sustainable alternatives to antibiotics in livestock production. Microbial biofilms, the dominant form of bacterial life, play a dualistic role in the poultry gastrointestinal tract: pathogenic biofilms enhance virulence and resistance to treatment, while beneficial biofilms are critical for intestinal homeostasis. This study presents a comprehensive strategy for targeted biofilm modulation based on the use of phytogenic compounds and their combinations with organic acids. In vitro (MBEC determination, confocal microscopy, RT-PCR) and in vivo (experiment on 1,100 broilers) methods demonstrated that the complex phytogenic additive (CPA) «Rezovet,» containing a synergistic composition of alkylresorcinols, indole compounds, and monobutyrates, selectively destroys pathogenic biofilms (Escherichia coli, Clostridium perfringens, Salmonella Enteritidis) by inhibiting quorum sensing and destabilizing the extracellular matrix. CPA also stimulates the formation of beneficial mucosal biofilms dominated by Akkermansia muciniphila and butyrate producers. A significant synergistic effect was observed between the combination of Rezovet and the organic acid Luprosil (FIC index 0.28-0.35), resulting in an in vivo improvement in feed conversion by 5.8%, an increase in flock survival by 3.9%, and a reduction in Salmonella spp. contamination by 2.1 log CFU/g. An economic analysis confirmed the high cost-effectiveness of both FDC monotherapy (ROI 567%) and combination regimens (ROI 507%). The results position targeted biofilm modulation as an effective and cost-effective strategy for sustainable poultry production in the post-antibiotic era.

Key words: microbial biofilms, phytogenic additives, alkylresorcinols, quorum sensing, Akkermansia muciniphila, organic acids, synergism, poultry farming, antimicrobial resistance, economic efficiency.

1. ВВЕДЕНИЕ

Промышленное птицеводство, являясь краеугольным камнем глобальной продовольственной безопасности, сталкивается с серьезными вызовами, связанными с десятилетиями чрезмерного использования антибиотиков. Глобальный кризис антимикробной резистентности (АМР) представляет собой не только медицинскую, но и серьезную экономическую угрозу. Согласно отчету O’Neill, кумулятивные потери мировой экономики от супербактерий к 2050 году могут достичь 100 триллионов долларов США [1]. В ответ на это введены строгие нормативные акты, такие как запрет ЕС на антибиотические стимуляторы роста и Технический регламент 044/2022 в ЕАЭС, что вынуждает отрасль искать эффективные альтернативы [2].

Ключевой проблемой, обуславливающей неэффективность многих традиционных подходов, являются микробные биопленки. Эти структурированные сообщества микроорганизмов, погруженные в само-продуцируемое внеклеточное полимерное вещество (ВПВ), представляют собой преобладающий способ существования бактерий в природе и промышленных системах [3, 4]. В кишечнике птицы патогенные биопленки, образуемые такими видами, как Salmonella spp., Escherichia coli и Clostridium perfringens, обеспечивают повышенную устойчивость к противомикробным препаратам и иммунным ответам хозяина, приводя к хроническим инфекциям и субоптимальной продуктивности [5].

Однако парадигма биопленок дуалистична. Полезные комменсалы, включая муцин-деградирующую Akkermansia muciniphila и различные виды Lactobacillus, также формируют биопленки или структурированные консорциумы внутри слизистого слоя [6]. Эти полезные биопленки критически важны для поддержания целостности кишечного барьера, обеспечения колонизационной резистентности против патогенов и модуляции иммунитета хозяина [7].

Таким образом, современная стратегия должна быть направлена не на тотальную эрадикацию биопленок, а на их прецизионную модуляцию: подавление патогенных и стимуляцию полезных. Перспективным инструментом для такой стратегии являются фитогенные соединения и их комбинации с другими классами соединений, такими как органические кислоты.

Целью данного исследования была разработка и комплексная оценка эффективности стратегии направленной модуляции микробных биопленок в промышленном птицеводстве на основе фитогенных соединений и их синергических комбинаций.

Задачи исследования:

1. Изучить in vitro антибиопленочную активность комплексной фитогенной добавки (КФД) «Резовет» и ее компонентов.
2. Оценить синергический эффект комбинаций КФД с органическими кислотами и другими коммерческими препаратами.
3. Исследовать молекулярные механизмы воздействия изучаемых композиций на ключевые гены вирулентности и систему кворум-сенсинга.
4. Определить in vivo эффективность моно- и комбинированной терапии на продуктивных показателях, микробиоме и здоровье кишечника бройлеров.
5. Провести экономический анализ применения разработанных схем.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Изучаемые препараты и композиции
В исследовании использовались коммерческие препараты, доступные на рынке РФ:

• Комплексная фитогенная добавка (КФД) «Резовет» (ООО «Стемтрикс»): стандартизированные алкилрезорцинолы (AR-C7-C9) 0,24%, индол-3-пропионовая кислота (ИПК) 0,08%, защищенные монобутираты 15%, бетаин 30%, экстракт розмарина 5%.
• Органические кислоты: «Лупрозил» (пропионовая кислота 60%, формиаты), «Актибон» (композиция муравьиной и пропионовой кислот).
• Пробиотики: «Бацелл» (Bacillus subtilis, B. licheniformis), «Пролам» (Bacillus subtilis).
• Ферментные препараты: «Профайнэз П» (комплекс протеаз), «Кемизайм П» (комплекс ферментов).
  Для оценки синергизма изучались комбинации, в частности, «Резовет» + «Лупрозил».

2.2. Оценка антибиопленочной активности in vitro

• Культивирование биопленок: Биопленки эталонных штаммов Salmonella Enteritidis, E. coli и C. perfringens выращивали в 96-луночных планшетах в течение 48 ч согласно методу O’Toole [8].
• Определение минимальной биопленко-эрадицирующей концентрации (MBEC): MBEC определяли как минимальную концентрацию препарата, вызывающую ≥80% снижение биомассы биопленки после окрашивания кристаллическим фиолетовым.
• Оценка синергизма: Индекс фракционной ингибирующей концентрации (FIC) определяли методом шахматная доска. FIC ≤0,5 интерпретировали как синергизм [9].
• Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: Структуру и жизнеспособность биопленок анализировали с использованием наборов LIVE/DEAD® BacLight™ и программы COMSTAT [10].
• Ингибирование кворум-сенсинга (IQS): Активность IQS оценивали с использованием биосенсорного штамма Chromobacterium violaceum CV026 согласно методу McLean et al. [11].

2.3. Молекулярный анализ

Методом ПЦР в реальном времени анализировали экспрессию генов, ассоциированных с биопленкообразованием (csgD, bcsA, luxS) и вирулентностью (hlyA, fliC). Нормализацию проводили относительно гена 16S рРНК. Выделение РНК проводили с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen), обратную транскрипцию — с использованием RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific). Амплификацию проводили на приборе CFX96 Touch (Bio-Rad).

2.4. In vivo эксперимент

• Дизайн: всего 1100 суточных цыплят-бройлеров кросса Ross 308 были случайным образом распределены на 11 групп (n=100). Группы включали контроль (базовый рацион), группы монотерапии («Резовет», «Лупрозил», «Бацелл» и др.) и группы комбинированной терапии («Резовет» + «Лупрозил» и др.).
• Параметры: в течение 42-дневного цикла регистрировали живую массу, потребление корма, конверсию корма, сохранность поголовья. На 14, 28 и 41 день отбирали пробы содержимого слепой кишки и соскобы слизистой оболочки для микробиологического, гистологического и молекулярного анализа.
• Анализ микробиома: Тотальную ДНК экстрагировали с использованием набора QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit (Qiagen). Секвенирование ампликонов гена 16S рРНК (участок V3-V4) проводили на платформе Illumina MiSeq (2×300 п.н.). Биоинформатический анализ проводили с использованием пайплайна DADA2 [12] в среде QIIME2 [13], таксономическую принадлежность определяли по базе данных SILVA (v.138) [14].
• Оценка кишечного барьера: гистологически оценивали толщину слизистого слоя и плотность бокаловидных клеток (окрашивание Alcian Blue/PAS) [15]. Экспрессию генов MUC2, окклюдина и ZO-1 определяли методом ПЦР-РВ.

2.5. Экономический анализ

Рассчитывали прямые затраты на препараты, дополнительный доход от улучшения продуктивных показателей, чистую прибыль и возврат инвестиций (ROI) в расчете на одну голову.

2.6. Статистический анализ

Данные анализировали с использованием однофакторного ANOVA с пост-хок тестом Тьюки в GraphPad Prism 9.0. Для анализа микробиома использовали PERMANOVA в пакете vegan для R [16]. Уровень значимости p <0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Сравнительная антибиопленочная активность in vitro
Препарат «Резовет» продемонстрировал статистически значимо наименьшие значения MBEC в отношении всех тестируемых патогенов (Таблица 1).

*Таблица 1. Минимальная биопленко-эрадицирующая концентрация (MBEC, мкг/мл) коммерческих препаратов*

Комбинация алкилрезорцинолов (AR-C9) и индол-3-пропионовой кислоты (ИПК) in vitro показала синергизм, снижая MBEC для E. coli в 4 раза по сравнению с монотерапией (8 мкг/мл против 32 мкг/мл и >128 мкг/мл соответственно). Конфокальная микроскопия подтвердила, что данная комбинация вызывает значительное нарушение структуры биопленки E. coli, уменьшая биомассу на 65 ± 7% и увеличивая долю мертвых клеток с 15 ± 3% до 62 ± 8%.

3.2. Синергические эффекты комбинированных препаратов
Наибольший синергический эффект был выявлен для комбинации «Резовет» + «Лупрозил» (Таблица 2). Данная комбинация позволяла снизить рабочие концентрации компонентов на 65-75% без потери эффективности.

Таблица 2. Индекс фракционной ингибирующей концентрации (FIC) комбинированных препаратов

3.3. Влияние на экспрессию генов вирулентности и кворум-сенсинг
Обработка комбинацией «Резовет» + «Лупрозил» приводила к максимальному подавлению экспрессии ключевых генов вирулентности в биопленках E. coli (Таблица 3). Алкилрезорцинолы в суб-МИК концентрациях ингибировали продукцию виолоцеина в тесте с C. violaceum на 75 ± 5%, что свидетельствует о мощной активности против системы кворум-сенсинга.

Таблица 3. Влияние препаратов на экспрессию генов вирулентности в биопленках E. coli (кратность изменения)

•  
• p <0,05 vs контроль; ** — p <0,01 vs контроль и монотерапия

3.4. Результаты in vivo эксперимента
3.4.1. Продуктивные показатели и здоровье кишечника
Комбинированная терапия («Резовет» + «Лупрозил») показала наилучшие результаты по всем учитываемым продуктивным показателям (Таблица 4).

Таблица 4. Продуктивные показатели бройлеров (42 дня)

•  
• p <0,05 vs контроль; ** — p <0,01 vs контроль

Гистологический анализ выявил в группе «Резовет» увеличение толщины слизистого слоя в подвздошной кишке на 35% (p <0,01) и плотности бокаловидных клеток на 42% (p <0,001). Экспрессия гена MUC2 была повышена в 2,3 раза, а белков плотных контактов (окклюдин, ZO-1) – на 65-72%.

3.4.2. Модуляция микробиом

Обработка КФД «Резовет» привела к значительным сдвигам в микробиоме. Наблюдалось увеличение альфа-разнообразия (индекс Шеннона 5,8 ± 0,4 против 4,1 ± 0,3 в контроле; p <0,01). Примечательно, что относительная численность Akkermansia muciniphila в мукозной микробиоте увеличилась в 2,4 раза к 41 дню (0,92% против 0,38% в контроле; p <0,001). Также значимо увеличилась численность бутират-продуцирующих семейств Lachnospiraceae и Ruminococcaceae, в то время как семейство Enterobacteriaceae было подавлено на 67%.

3.4.3. Микробиологический статус
В группе комбинации «Резовет» + «Лупрозил» контаминация Salmonella spp. в слепых отростках снизилась на 2,1 log КОЕ/г (1,7 log КОЕ/г против 3,8 log КОЕ/г в контроле).

3.5. Экономический анализ
Применение как монотерапии «Резовет», так и комбинированной схемы показало высокую экономическую эффективность (Таблица 5). Окупаемость затрат достигалась в течение одного производственного цикла.

Таблица 5. Экономическая эффективность применения препаратов (расчет на 1 голову)

4. ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты демонстрируют возможность успешного переноса концепций экологического инжиниринга биопленок из растениеводства в животноводство. Подход, используемый для управления ризосферными сообществами [17], может быть адаптирован для модуляции кишечного микробиома птицы.

4.1. Механизмы подавления патогенных биопленок

Высокая эффективность КФД «Резовет» и ее комбинации с органическими кислотами обусловлена синергизмом многокомпонентного состава и дополнительный механизмами действия.

1. Алкилрезорцинолы благодаря оптимальному амфифильному балансу эффективно интегрируются в бактериальные мембраны, нарушая их целостность [18]. Это подтверждается данными конфокальной микроскопии о значительном увеличении доли мертвых клеток.
2. Индольные соединения и, в меньшей степени, алкилрезорцинолы, действуют как мощные ингибиторы кворум-сенсинга, нарушая коммуникацию между бактериальными клетками и координацию формирования биопленки [19].
3. Органические кислоты (в комбинации) разрушают внеклеточный матрикс биопленок и снижают pH, создавая неблагоприятные условия для патогенов и облегчая проникновение фитогенных соединений к бактериальным клеткам [20].

Подавление экспрессии генов csgD и luxS указывает на целевое воздействие на ключевые регуляторные пути биопленкообразования и вирулентности, что согласуется с данными о других фитогенных соединениях, таких как куркумин [21].

4.2. Стимуляция полезных мукозных биопленок

Способность КФД стимулировать рост Akkermansia muciniphila представляет особый интерес. Этот муцин-деградирующий симбионт играет ключевую роль в поддержании целостности слизистого барьера [7]. Его увеличение, вероятно, опосредовано несколькими факторами:

• Утолщение слизистого слоя и повышение экспрессии MUC2, индуцируемое компонентами КФД, создает дополнительный субстрат для A. muciniphila.
• Монобутираты в составе КФД могут служить вторичным субстратом для мукозных симбионтов [22].

Таким образом, КФД создает экологическую нишу, благоприятную для полезных симбионтов и неблагоприятную для патогенов, что напоминает принципы, используемые в растениеводстве для усиления роста ризобактерий [17].

4.3. Практическая значимость и экономическая целесообразность
Выявленный синергизм позволяет не только повысить эффективность контроля биопленок, но и значительно снизить экономические затраты на применение препаратов. Высокая рентабельность (ROI >500%) и окупаемость в течение одного цикла делают предлагаемые схемы крайне привлекательными для промышленного внедрения в условиях российского птицеводства, особенно в контексте реализации стратегии импортозамещения и снижения зависимости от антибиотиков.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Разработана и научно обоснована комплексная стратегия направленной модуляции микробных биопленок в кишечнике птицы, основанная на селективном подавлении патогенных и стимуляции полезных биопленочных сообществ.
2. Доказана высокая эффективность комплексной фитогенной добавки «Резовет» in vitro и in vivo. КФД проявляет синергическую антибиопленочную активность против ключевых патогенов (MBEC 4,8-8,2 мкг/мл) за счет ингибирования кворум-сенсинга и мембранотропного действия, и одновременно стимулирует рост полезной микробиоты, в частности Akkermansia muciniphila (+240%).
3. Впервые для российских препаратов выявлен выраженный синергизм комбинации фитогенных соединений с органическими кислотами. Комбинация «Резовет» + «Лупрозил» (FIC 0,28-0,35) позволяет снизить рабочие концентрации на 65-75% и оказывает мощное подавляющее действие на экспрессию генов вирулентности (csgD, luxS, fliC, hlyA).
4. Подтверждена практическая эффективность и экономическая целесообразность применения стратегии in vivo. Комбинированная схема позволила улучшить конверсию корма на 5,8%, увеличить сохранность на 3,9%, снизить контаминацию Salmonella spp. на 2,1 log КОЕ/г и обеспечить рентабельность на уровне 507%.
5. Предложены дифференцированные схемы применения для промышленных птицеводческих предприятий РФ, включая базовую профилактику, интенсифицированные программы и целевые схемы против клостридиозов.

Перспективы дальнейших исследований связаны с углубленным изучением молекулярных механизмов взаимодействия фитогенных соединений с микробными консорциумами, а также с разработкой прецизионных программ модуляции микробиома для различных производственных условий и кроссов птицы.

ЛИТЕРАТУРА

1. O’Neill, J. Tackling Drug-Resistant Infections Globally: Final Report and Recommendations // The Review on Antimicrobial Resistance. – 2016. DOI: 10.1038/510015a
2. Van Boeckel, T.P., Pires, J., Silvester, R., et al. Global trends in antimicrobial resistance in animals in low- and middle-income countries // Science. – 2019. – Vol. 365(6459). DOI: 10.1126/science. aaw1944
3. Flemming, H.-C., Wingender, J. The biofilm matrix // Nature Reviews Microbiology. – 2010. – Vol. 8(9). – P. 623-633. DOI: 10.1038/nrmicro2415
4. Costerton, J.W., Stewart, P.S., Greenberg, E.P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections // Science. – 1999. – Vol. 284(5418). – P. 1318-1322. DOI: 10.1126/science.284.5418.1318
5. Donlan, R.M. Biofilms: microbial life on surfaces // Emerging Infectious Diseases. – 2002. – Vol. 8(9). – P. 881-890. DOI: 10.3201/eid0809.020063
6. Derrien, M., Vaughan, E.E., Plugge, C.M., de Vos, W.M. Akkermansia muciniphila gen. nov., sp. nov., a human intestinal mucin-degrading bacterium // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. – 2004. – Vol. 54(5). – P. 1469-1476. DOI: 10.1099/ijs.0.02873-0
7. Derrien, M., Belzer, C., de Vos, W.M. Akkermansia muciniphila and its role in regulating host functions // Microbial Pathogenesis. – 2017. – Vol. 106. – P. 171-181. DOI: 10.1016/j.micpath.2016.02.005
8. O’Toole, G.A. Microtiter dish biofilm formation assay // Journal of Visualized Experiments. – 2011. – Vol. 47. – P. 2437. DOI: 10.3791/2437
9. Odds, F.C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. – 2003. – Vol. 52(1). – P. 1. DOI: 10.1093/jac/dkg301
10. Heydorn, A., Nielsen, A.T., Hentzer, M., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT // Microbiology. – 2000. – Vol. 146(10). – P. 2395-2407. DOI: 10.1099/00221287-146-10-2395
11. McLean, R.J., Pierson, L.S., Fuqua, C. A simple screening protocol for the identification of quorum signal antagonists // Journal of Microbiological Methods. – 2004. – Vol. 58(3). – P. 351-360. DOI: 10.1016/j.mimet.2004.04.016
12. Callahan, B.J., McMurdie, P.J., Rosen, M.J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data // Nature Methods. – 2016. – Vol. 13(7). – P. 581-583. DOI: 10.1038/nmeth.3869
13. Bolyen, E., Rideout, J.R., Dillon, M.R., et al. Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2 // Nature Biotechnology. – 2019. – Vol. 37(8). – P. 852-857. DOI: 10.1038/s41587-019-0209-9
14. Quast, C., Pruesse, E., Yilmaz, P., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools // Nucleic Acids Research. – 2013. – Vol. 41(D1). – P. D590-D596. DOI: 10.1093/nar/gks1219
15. Kim, Y.S., Ho, S.B. Intestinal goblet cells and mucins in health and disease: recent insights and progress // Current Gastroenterology Reports. – 2010. – Vol. 12(5). – P. 319-330. DOI: 10.1007/s11894-010-0131-2
16. Oksanen, J., Blanchet, F.G., Friendly, M., et al. vegan: Community Ecology Package. R package version 2.5-7. – 2020.
17. Pandit, A., Adholeya, A., Cahill, D., Brau, L., Kochar, M. Microbial biofilms in nature: unlocking the potential for agricultural applications // Journal of Applied Microbiology. – 2020. – Vol. 129(2). – P. 199-211. DOI: 10.1111/jam.14609
18. Kozubek, A., Zarnowski, R. Resorcinolic lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity // Chemical Reviews. – 2001. – Vol. 101(11). – P. 3353-3386. DOI: 10.1021/cr000120o
19. Kim, H.S., Lee, S.H., Byun, Y., Park, H.D. 6-Gingerol reduces Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and virulence via quorum sensing inhibition // Scientific Reports. – 2015. – Vol. 5. – P. 8656. DOI: 10.1038/srep08656
20. Ricke, S.C. Perspectives on the use of organic acids and short chain fatty acids as antimicrobials // Poultry Science. – 2003. – Vol. 82(4). – P. 632-639. DOI: 10.1093/ps/82.4.632
21. Zhou, J.-W., Luo, H.-Z., Jiang, H., et al. Curcumin inhibits biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa by elevating c-di-GMP level // Applied and Environmental Microbiology. – 2018. – Vol. 84(18). – P. e00762-18. DOI: 10.1128/AEM.00762-18
22. Van Herreweghen, F., De Paepe, K., Marzorati, M., Van de Wiele, T. In vitro colonization of the distal colon by Akkermansia muciniphila is largely mucin and pH dependent // Beneficial Microbes. – 2020. – Vol. 11(4). – P. 395-406. DOI: 10.3920/BM2019.0165