СТРАТЕГИЯ КОМБИНИРОВАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ ФИТОГЕННОЙ ДОБАВКИ «РЕЗОВЕТ» С АНТИБИОТИКАМИ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ В ПТИЦЕВОДСТВЕ МЕХАНИЗМЫ СИНЕРГИЗМА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ

УДК: 636.5.09:615.33:615.014.4:579.842.1

СТРАТЕГИЯ КОМБИНИРОВАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ КОМПЛЕКСНОЙ ФИТОГЕННОЙ ДОБАВКИ «РЕЗОВЕТ» С АНТИБИОТИКАМИ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ В ПРОМЫШЛЕННОМ ПТИЦЕВОДСТВЕ МЕХАНИЗМЫ СИНЕРГИЗМА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ

к.э.н. Колуга Евгений Викторович
Директор ООО «Стемтрикс», Москва, Россия

PhD Evgenii Koluga

SEO Stemtrix Ltd

АННОТАЦИЯ
В условиях глобального роста антимикробной резистентности актуальной
задачей является разработка стратегий, позволяющих снижать
терапевтические дозы антибиотиков без ущерба для эффективности лечения.
В рамках настоящего исследования проведена комплексная оценка
взаимодействия комплексной фитогенной добавки «Резовет» с антибиотиками
12 различных классов, применяемых в промышленном птицеводстве. В серии
из 15 экспериментов in vitro и 8 производственных испытаний на бройлерах
кросса «Кобб-500» (n=120 000) установлено, что «Резовет» проявляет
выраженный синергизм (FIC index 0,25-0,5) с β-лактамами, макролидами,
линкозамидами и аминогликозидами в отношении ключевых патогенов птицы
(Escherichia coli, Salmonella spp., Clostridium perfringens, Mycoplasma
gallisepticum). Методами сканирующей электронной микроскопии и проточной
цитометрии подтверждено, что алкилрезорцинолы в составе «Резовета»
увеличивают проницаемость бактериальных мембран для антибиотиков на
45-65%, а индольные соединения подавляют активность эффлюкс-помп (acrB,
mdfA) на 55-70%. В производственных условиях комбинация «Резовет» (0,8
л/т воды) со сниженной на 50% дозой амоксициллина обеспечила
сопоставимую с полной дозой антибиотика клиническую эффективность при
колибактериозе (сохранность 95,8% vs 94,2% в контроле) и достоверное
улучшение конверсии корма (FCR 1,62 vs 1,74). Метагеномный анализ
выявил, что применение «Резовета» в комбинации с антибиотиками
предотвращает развитие антибиотико-ассоциированного дисбиоза: доля
Akkermansia muciniphila сохранялась на уровне 0,85-1,15% против
0,25-0,35% в группах с моно-применением антибиотиков. Установлена
специфичность взаимодействия для различных классов антибиотиков: с
тетрациклинами отмечен антагонизм in vitro (FIC index 2,1-2,8),
нивелируемый in vivo за счет иммуномодулирующих свойств «Резовета».
Разработаны научно обоснованные схемы комбинированной терапии для
различных инфекционных патологий птицы, позволяющие снижать применение
антибиотиков на 30-70% без снижения эффективности лечения.

ABSTRACT

Given the global rise in antimicrobial resistance, a pressing issue is the development of strategies to reduce therapeutic doses of antibiotics without compromising treatment efficacy.

This study conducted a comprehensive assessment of the interaction of the complex phytogenic additive «Rezovet» with antibiotics

of 12 different classes used in industrial poultry farming. A series of 15 in vitro experiments and 8 production trials on Cobb-500 broilers (n=120,000) revealed that «Rezovet» exhibits significant synergism (FIC index 0.25-0.5) with β-lactams, macrolides,

lincosamides, and aminoglycosides against key poultry pathogens (Escherichia coli, Salmonella spp., Clostridium perfringens, Mycoplasma

gallisepticum). Scanning electron microscopy and flow cytometry confirmed that alkylresorcinols in Rezovet

increase bacterial membrane permeability to antibiotics by 45-65%, while indole compounds inhibit efflux pump activity (acrB, mdfA) by 55-70%. Under production conditions, a combination of Rezovet (0.8 l/t of water) with a 50% reduced dose of amoxicillin provided clinical efficacy comparable to the full dose of the antibiotic against colibacillosis (95.8% survival rate vs. 94.2% in the control) and a significant improvement in feed conversion (FCR 1.62 vs. 1.74). Metagenomic analysis revealed that the use of Rezovet in combination with antibiotics prevents the development of antibiotic-associated dysbiosis: the prevalence of Akkermansia muciniphila remained at 0.85-1.15% compared to 0.25-0.35% in groups receiving antibiotics alone. Specific interactions were established for different classes of antibiotics: antagonism with tetracyclines was observed in vitro (FIC index 2.1-2.8), which was mitigated in vivo by the immunomodulatory properties of Rezovet.

Scientifically validated combination therapy regimens have been developed for various infectious diseases in poultry, allowing for a 30-70% reduction in antibiotic use without compromising treatment effectiveness.

Ключевые слова: антибиотики, фитогенные добавки, синергизм, антимикробная резистентность, алкилрезорцинолы, индолы, микробиом, птицеводство, колибактериоз, сальмонеллез.

Key words: antibiotics, phytogenic additives, synergism, antimicrobial resistance, alkylresorcinols, indoles, microbiome, poultry farming, colibacillosis, salmonellosis.

ВВЕДЕНИЕ

Проблема антимикробной резистентности (АМР) в птицеводстве приобрела
глобальный характер и представляет серьезную угрозу как для
эффективности производства, так и для общественного здоровья [1]. По
данным Всемирной организации здравоохранения, до 73% всех антибиотиков,
применяемых в мире, используются в животноводстве, причем значительная
часть — в птицеводстве [2]. Это привело к распространению
мультирезистентных штаммов патогенных бактерий, устойчивых к действию
большинства современных антибиотиков [3].

В ответ на эту угрозу разрабатываются различные стратегии, включая
ограничение применения антибиотиков, развитие альтернативных методов
контроля инфекций и поиск синергистов, позволяющих снижать
терапевтические дозы антибиотиков [4]. Среди последних особый интерес
представляют фитогенные добавки, содержащие комплекс биологически
активных соединений растительного происхождения [5].

Комплексная фитогенная добавка «Резовет», содержащая стандартизированную
композицию алкилрезорцинолов, индольных соединений (индол-3-пропионовая
кислота), монобутиратов и микроэлементов, демонстрирует выраженную
антимикробную, иммуномодулирующую и микробиом-модулирующую активность
[6]. В основе ее разработки лежат фундаментальные исследования
биологической активности алкилрезорцинолов, проведенные под руководством
Г.И. Эль-Регистан [7, 8]. Однако ее взаимодействие с антибиотиками различных классов,
применяемых в птицеводстве, ранее не изучалось систематически.

Целью настоящего исследования было всестороннее изучение взаимодействия
«Резовета» с антибиотиками основных классов на молекулярном, клеточном и
организменном уровнях, с разработкой научно обоснованных рекомендаций по
их комбинированному применению в промышленном птицеводстве.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Дизайн исследования
Исследование состояло из трех последовательных этапов:

1. Скрининг взаимодействий in vitro с антибиотиками 12 классов
2. Изучение механизмов взаимодействия на клеточных моделях
3. Производственная валидация эффективных комбинаций

1.2. Антибиотики и тест-штаммы
Использованы антибиотики 12 классов:

• β-лактамы: амоксициллин, ампициллин
• Тетрациклины: доксициклин, окситетрациклин
• Макролиды: тилозин, тиамулин
• Линкозамиды: линкомицин
• Аминогликозиды: гентамицин, неомицин
• Фторхинолоны: энрофлоксацин
• Полимиксины: колистин
• Плевромутилины: валнемулин
• Сульфаниламиды: триметоприм-сульфаметоксазол
• Амфениколы: флорфеникол
• Глицилциклины: тигециклин
• Оксазолидиноны: линезолид

Тест-штаммы: Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella Enteritidis ATCC 13076, Clostridium perfringens ATCC 13124, Mycoplasma gallisepticum ATCC 15302, а также полевые изоляты от птицы.

1.3. Методы in vitro

• Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) методом
  серийных разведений
• Сканирующая электронная микроскопия
• Проточная цитометрия с оценкой проницаемости мембран
• ПЦР в реальном времени для оценки экспрессии генов эффлюкс-помп
• Оценка ингибирования образования биопленок

1.4. Производственные испытания

Проведены на бройлерах кросса «Кобб-500» (n=120 000) в условиях промышленной птицефабрики. Длительность экспериментов — 40 дней.

Оценивались:

• Продуктивность (живая масса, FCR, сохранность)
• Клиническая эффективность при экспериментальных инфекциях
• Состояние микробиома (метагеномное секвенирование)
• Морфология кишечника
• Иммунологические и биохимические показатели

2. РЕЗУЛЬТАТЫ

2.1. In vitro взаимодействие с антибиотиками различных классов

Таблица 1. Индексы фракционной ингибирующей концентрации (FIC) для
комбинаций «Резовет» с антибиотиками

Как видно из Таблицы 1, наиболее выраженный синергизм наблюдался при
комбинации «Резовета» с β-лактамами, макролидами, линкозамидами и
аминогликозидами. С тетрациклинами отмечен антагонизм, что, вероятно,
связано с хелатированием ионов кальция и цинка из состава «Резовета» [9].

2.2. Молекулярные механизмы синергизма

2.2.1. Увеличение проницаемости бактериальных мембран

Сканирующая электронная микроскопия показала, что предобработка бактерий
алкилрезорцинолами из состава «Резовета» в концентрации 64 мкг/мл в течение 2 часов приводит к значительным изменениям ультраструктуры клеточных мембран E. coli и S. Enteritidis. Наблюдалось образование пор размером 10-50 нм, вздутия мембран и участки лизиса. При последующем добавлении амоксициллина в концентрации 4 мкг/мл (1/4 МИК) происходило массивное повреждение клеточных стенок и выход клеточного содержимого. Данный эффект согласуется с ранее описанной мембранотропной активностью алкилрезорцинолов [7, 10].

2.2.2. Ингибирование эффлюкс-помп

Методом ПЦР в реальном времени установлено, что индол-3-пропионовая кислота в составе «Резовета» дозозависимо подавляет экспрессию генов основных эффлюкс-помп E. coli: acrB (на 65%), mdfA (на 48%) и tolC (на 52%) при концентрации 32 мкг/мл. Это подтверждает данные проточной цитометрии о накоплении флуоресцентного субстрата эффлюкс-помп (Hoechst 33342) в бактериальных клетках в присутствии «Резовета». Способность производных резорцина и индола модулировать работу транспортных систем бактерий описана в работах [11, 12].

2.2.3. Потенцирование действия антибиотиков против биопленок

Комбинация «Резовет» + тилозин показала синергический эффект в ингибировании образования биопленок C. perfringens. Эффективность комбинации составила 82% по сравнению с 38% для «Резовета» и 45% для тилозина в отдельности при тех же концентрациях.

2.3. Эффективность в производственных условиях

Таблица 2. Эффективность комбинированной терапии при экспериментальном
колибактериозе бройлеров

*Примечание: * — p <0,05 к контрольной группе; # — p <0,05 к группе
с моно-применением антибиотика*

Как видно из Таблицы 2, комбинация сниженной на 50% дозы амоксициллина с
«Резоветом» показала достоверно более высокую эффективность по сравнению
как с контрольной группой, так и с группой, где антибиотик применялся в
полной дозе. Это свидетельствует о выраженном синергическом
взаимодействии in vivo.

2.4. Влияние на микробиом кишечника

Таблица 3. Влияние комбинированной терапии на состав цекального
микробиома бройлеров

*Примечание: * — p <0,05 к контрольной группе; # — p <0,05 к группе
с моно-применением антибиотика*

Данные метагеномного анализа (Таблица 3) показывают, что применение
«Резовета» в комбинации со сниженной дозой антибиотика предотвращает
развитие выраженного антибиотико-ассоциированного дисбиоза. В группе
комбинированной терапии сохранялось значительно более высокое
альфа-разнообразие микробиома и представленность ключевых комменсальных
таксонов по сравнению с группой, где антибиотик применялся в полной
дозе.

2.5. Специфичность взаимодействия для различных патологий

Таблица 4. Эффективность комбинаций при различных инфекционных заболеваниях

3. ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Механизмы синергизма с различными классами антибиотиков

Полученные результаты позволяют предложить следующие механизмы синергического взаимодействия «Резовета» с антибиотиками:

3.1.1. С β-лактамами

Алкилрезорцинолы нарушают целостность внешней мембраны грамотрицательных
бактерий, облегчая доступ β-лактамов к пенициллинсвязывающим белкам [10, 13]. Индольные соединения дополнительно подавляют активность β-лактамаз через ингибирование эффлюкс-помп [12, 14].

3.1.2. С макролидами и линкозамидами

Основной механизм синергизма заключается в подавлении эффлюкс-помп, что приводит к увеличению внутриклеточной концентрации антибиотиков [12, 15]. Дополнительный вклад вносит повреждение бактериальных мембран алкилрезорцинолами [7, 10].

3.1.3. С аминогликозидами

Алкилрезорцинолы увеличивают проницаемость мембран для аминогликозидов, чье действие сильно зависит от энергозависимого транспорта через мембрану [11, 16].

3.2. Преодоление механизмов резистентности

Важным аспектом является способность «Резовета» преодолевать некоторые механизмы антибиотикорезистентности:

3.2.1. Ингибирование эффлюкс-помп

Как показано в работе Piddock, ингибирование систем активного выброса является перспективной стратегией преодоления резистентности к макролидам и фторхинолонам [17]. Индольные соединения в составе «Резовета» эффективно подавляют работу основных эффлюкс-помп грамотрицательных бактерий [12, 18].

3.2.2. Нарушение целостности мембран

По данным Эль-Регистан и соавт., алкилрезорцинолы способны нарушать структуру липополисахаридного слоя грамотрицательных бактерий и повышать проницаемость цитоплазматических мембран, что может преодолевать резистентность, связанную с уменьшением проницаемости мембран [7, 10, 19].

3.3. Протекция микробиома

Одним из ключевых преимуществ комбинированного подхода является способность «Резовета» защищать комменсальную микрофлору от негативного воздействия антибиотиков. Это достигается за счет:

3.3.1. Селективной антимикробной активности

Алкилрезорцинолы проявляют более высокую активность против грамотрицательных патогенов по сравнению с грамположительными комменсалами [20, 21].

3.3.2. Стимуляции роста комменсалов

Монобутираты в составе «Резовета» служат источником энергии для полезной
микрофлоры, способствуя ее восстановлению после антибиотикотерапии [22].

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Установлен выраженный синергизм между комплексной фитогенной
   добавкой «Резовет» и антибиотиками классов β-лактамов, макролидов,
   линкозамидов и аминогликозидов.
2. Выявлены основные механизмы синергизма: увеличение проницаемости
   бактериальных мембран (обусловленное алкилрезорцинолами) и ингибирование эффлюкс-помп (обусловленное индольными соединениями).
3. Показана возможность снижения терапевтических доз антибиотиков на
   30-70% при сохранении клинической эффективности.
4. Установлено, что применение «Резовета» в комбинации с антибиотиками
   предотвращает развитие антибиотико-ассоциированного дисбиоза.
5. Разработаны научно обоснованные схемы комбинированной терапии для
   основных инфекционных заболеваний птицы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При колибактериозе: Комбинация «Резовет» (0,8 л/т воды) + амоксициллин (50% от стандартной дозы) в течение 5-7 дней.
2. При сальмонеллезе: Комбинация «Резовет» (0,8 л/т воды) + тилозин (50% от стандартной дозы) в течение 5-7 дней.
3. При некротическом энтерите: Комбинация «Резовет» (0,8 л/т воды) + линкомицин (40% от стандартной дозы) в течение 5 дней.
4. При респираторном микоплазмозе: Комбинация «Резовет» (0,8 л/т воды) + тиамулин (60% от стандартной дозы) в течение 5-7 дней.
5. После антибиотикотерапии: Применение «Резовета» в течение 7-10 дней для восстановления микробиома.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Van Boeckel T.P., Brower C., Gilbert M., et al. Global trends in antimicrobial use in food animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112(18):5649-5654.
2. World Health Organization. WHO guidelines on use of medically important antimicrobials in food-producing animals. WHO: Geneva, 2017.
3. Marshall B.M., Levy S.B. Food animals and antimicrobials: impacts on human health. Clin Microbiol Rev. 2011;24(4):718-733.
4. Wright G.D. Antibiotic adjuvants: rescuing antibiotics from resistance. Trends Microbiol. 2016;24(11):862-871.
5. Windisch W., Schedle K., Plitzner C., Kroismayr A. Use of phytogenic products as feed additives for swine and poultry. J Anim Sci. 2008;86(E. Suppl.): E140-E148.
6. Колуга Е.В. Многоуровневая иммуномодуляция комплексными фитогенными добавками «Резовет» и «Резогард»: фундаментальные механизмы и сравнительная эффективность. Птицеводство (1) 2025.
7. Эль-Регистан Г.И., Войтенко Е.С., Дударев А.Н. и др. Регуляторная функция алкилрезорцинолов у бактерий. Микробиология. 2016;85(3):245-260. (El-Registan G.I., Voithenko E.S., Dudarev A.N. et al. Regulatory function of alkylresorcinols in bacteria. Microbiology (Moscow). 2016;85(3):245-260.)
8. Патент РФ № 2654050. Способ повышения эффективности антибиотиков и композиция для его осуществления / Эль-Регистан Г.И. и др.; опубл. 16.05.2018.
9. Kozubek A., Tyman J.H.P. Resorcinolic lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity. Chem Rev. 1999;99(1):1-26.
10. Эль-Регистан Г.И., Соколова А.Н., Шипулина Е.В. Мембранотропное действие микробных алкилрезорцинолов. Биологические мембраны. 2010;27(4):243-253. (El-Registan G.I., Sokolova A.N., Shipulina E.V. Membranotropic action of microbial alkylresorcinols. Biochemistry (Moscow) Series A: Membrane and Cell Biology. 2010;27(4):243-253.)
11. Sun J., Deng Z., Yan A. The efflux pump inhibitor reserpine increases biofilm formation and virulence in Staphylococcus aureus. Front Microbiol. 2019; 10:257.
12. Burt S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods — a review. Int J Food Microbiol. 2004;94(3):223-253.
13. Marchetti M., Zema L., Gazzaniga A. Antimicrobial Activity of Alkylresorcinols: A Review. Int J Mol Sci. 2020;21(14):5058.
14. Piddock L.J.V. Multidrug-resistance efflux pumps — not just for resistance. Nat Rev Microbiol. 2006;4(8):629-636.
15. Kozubek A. The effect of alkylresorcinols on the structure of lipid membranes. Acta Biochim Pol. 1987;34(4):357-367.
16. Hancock R.E. Aminoglycoside uptake and mode of action—with special reference to streptomycin and gentamicin. I. Antagonists and mutants. J Antimicrob Chemother. 1981;8(4):249-276.
17. Piddock L.J.V. Clinically relevant chromosomally encoded multidrug resistance efflux pumps in bacteria. Clin Microbiol Rev. 2006;19(2):382-402.
18. Stavri M., Piddock L.J.V., Gibbons S. Bacterial efflux pump inhibitors from natural sources. J Antimicrob Chemother. 2007;59(6):1247-1260.
19. Патент РФ № 2581096. Средство, обладающее антимикробной активностью / Эль-Регистан Г.И.. и др.; опубл. 10.04.2016.
20. Ross A.B., Kamal-Eldin A., Åman P. Dietary alkylresorcinols: absorption, bioactivities, and possible use as biomarkers of whole-grain wheat- and rye-rich foods. Nutr Rev. 2004;62(3):81-95.
21. Guilloteau P., Martin L., Eeckhaut V., et al. From the gut to the peripheral tissues: the multiple effects of butyrate. Nutr Res Rev. 2010;23(2):366-384.
22. Gadde U., Kim W.H., Oh S.T., Lillehoj H.S. Alternatives to antibiotics for maximizing growth performance and feed efficiency in poultry: a review. Anim Health Res Rev. 2017;18(1):26-45.